Протокол выделения геномной ДНК, обычно используемый в нашей лаборатории

Main reference and great respect: Doyle JJ, Doyle JL. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem. Bull. Bot. Soc. Amer. Vol. 19. P. 11 - 15.

• В нашей лаборатории мы работаем с тканями листьев растений в высушенном виде (фиксированные в спирте и высушенные, либо гербарные образцы)
• "холодный" = (-20⁰C)
• "V" = объём. Добавляемое количество V рассчитывается относительно имеющегося на момент добавления реального объёма жидкости.

Протокол

1. Вымыть растения, если имеются загрязнения, в 70⁰ этаноле, высушить на воздухе или при 37⁰

2. Перетереть в минимальном количестве Al₂O ₃ в деконтаминированной щёлочью ступке

3. Засыпать в 1.5 мл-ый эппендорф 0.5 мл мацерата

4. + 500 мкл TES-буфера* (если недостаточно, добавить), размешать иглой, если необходимо, до полного смачивания порошка + 50 мкл бета-меркаптоэтанола в тяге. (Можно оставить при комнатной температуре на несколько дней в фотокомнате.) Инкубировать 60 мин / 65 ⁰ С, периодически аккуратно помешивая переворачиванием.

5. + 300 мкл 3М NaCl = 140 мкл 5М NaCl + 70 мкл 10%-го CTAB-буфера** (применяя методы набора вязких жидкостей!), breaf vortex, / инкубировать 10 мин / 65 ⁰

6. + 700 мкл хлороформа/изоамилового спирта (24:1=V:V), встряхнуть на вортексе

7. Центрифугировать 10000 об/мин / 5 – 10 мин. Отобрать верхнюю фазу, содержащую ДНК, в чистый эппендорф

8. Повторить этапы 6 - 7. Если преципитация намечается в объёме, большем 1.8 мл, разаликвотить (2 эпп. по прим. 300 мкл)

9. Преципитировать ДНК с помощью холодного этанола или изопропанола в присутствии соли, примеры вариантов:

9.1. + 200 мкл 3М ацетата Na (ко всему объёму верхней фазы) (рН 5.5) + 600 мкл холодного 96⁰ этанола. Осторожно перемешать переворачиванием, инкубировать 20 мин или более для осаждения ДНК / -20 ⁰

9.2. + равный V 5М ацетата аммония (конечная С = 2-2.5М) + 2-2.5 V холодного 96⁰ этанола или 0.65-1 V изопропанола. Осторожно перемешать переворачиванием, инкубировать 20 мин или более для осаждения ДНК /

- 20 ^{0 С} (Если ДНК много, можно инкубировать меньше).

10. Центрифугировать 10000 об/мин / 10 мин

11. Осторожно удалить супернатант

12. + 300-500 мкл холодного 70⁰ этанола, vortex, центрифугировать 10000 об/мин / минут 5.

13. Повторить этап 12 ещё дважды

14. Пробы высушить при 37⁰ или К⁰ или 60-65⁰/10 мин до исчезновения запаха спирта

15. + 50-100 мкл инъекционной воды. Оставить при К⁰  или +4⁰ или 60-65⁰ /10 мин

16. Проверить наличие, качество и концентрацию ДНК электрофорезом в 0.8 – 1%-ом агарозном геле.

 * TES-буфер: 100 мМ Tris, pH 8.0; 10 мМ EDTA; 2 % SDS,

** СТАВ-буфер: 10 % СТАВ, 50 мМ Tric-HCl, рН 8.0, 0.7 мМ EDTA (хранить при температуре выше 15⁰С)

 

 

http://www.plantcaryo.narod.ru/protocols/p1.htm